Vector Systems
ショウジョウバエ遺伝子ターゲッティング用ドナーベクター
概要
当社のショウジョウバエ遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターは、相同組み換えによって、外来性ドナーテンプレートを効率よくゲノムの標的部位に導入できるよう設計されています。標的ゲノムDNA配列はDNAテンプレート配列に組み換えられるため、点変異やDNA配列のノックインなど大幅な改変が可能になります。
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9システムは、さまざまな生物において、in vitroおよびin vivoで、遺伝子を不活性化することができます。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。Cas9はゲノムをスクリーニングし、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）NGGの直前に位置する、gRNAに相補的な配列を切断します。二本鎖切断はその後、相同組換えまたは非相同末端結合によって修復され、その結果、様々な長さのインデル（ゲノム中への数塩基の挿入または欠失）が作出されます。
相同組み換えはCas9によるDNA double-strand break (DSB)修復に必須の経路となります。CRISPR/Cas9コンポーネントと外来性ドナーDNAテンプレートを同時に導入すると、DSB はhomology-directed repair (HDR) によって修復されます。HDRによって標的ゲノムDNA配列は、点変異やノックイン用フラグメントを含むドナーベクターのシークエンス置き換わります。
当ドナーベクターは任意のインサート配列の上流と下流にホモロジーアームを含み、このホモロジーアーム間には、loxPサイトで挟まれた蛍光マーカー（DsRed）が存在します。ホモロジーアームの長さは、希望する編集のサイズに応じて調整されますが、インサートが長いほど長いアームが必要となります。ドナー配列は5’ホモロジーアームのすぐ隣にデザインされます。また、宿主でのattP“着地点”サイトの位置を決めるため、attP配列がクローニングされます。これにより、φC31インテグラーゼを介した部位特異的なゲノム組換えのためのトランスジェニックショウジョウバエ胚が作製できます。
効果的にHDRターゲッティングするには、Cas9によるDSBは、挿入予定配列の近傍（ホモロジーアームの10‐15bp以内にあることが理想）に作出されるある必要があります。さらに、HDR用にドナーベクターを設計する場合にはCas9がHDR後のゲノムサイトを再切断してしまう可能性を排除するためにPAM配列を取り除く、もしくは改変することが重要です。
当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください。
| 文献 | トピック |
|---|---|
| Methods Mol Biol. 420:155-74 (2008) Science. 288:2013-8 (2000) |
Homologous recombination in Drosophila |
| Biotechniques. 59:201 (2015) | CRISPR/HDR-mediated knockin of large DNA fragments |
| Proc Natl Acad Sci U S A. 104:3312-7 (2007) | Generation of φC31-based transgenic Drosophila |
| Science. 339:819-23 (2013) | Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system |
特長
当社の遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターはCRISPRターゲッティングによって標的ゲノムサイトに作られたDSBを利用してHDRによる任意の配列（レポーター、蛍光タグまたはその他のDNA配列など）を挿入できるように設計されています。当ドナーベクターは任意の挿入配列の上流と下流に相同配列を組み込めるように設計されており、CRISPRによって作出されたDSBによって、効率よく組換えを起こすことができます。
メリット
正確な改変：遺伝子ターゲッティング用ドナーベクターとして外来性修復テンプレートを導入することで標的ゲノム配列にHDRによる正確な配列改変をおこなえます。
デメリット
効率の低さ：Cas9による標的配列切断後の修復はNHEJが主であり、HDRによる修復頻度は非常に低くなります。そのため、外来性ドナーDNAテンプレートを用いたCRISPR/Cas9ターゲティングでは、NHEJ修復された細胞とHDR修復された細胞が混在する細胞集団が生じます。得られた細胞集団からHDRによる目的のゲノム編集を受けた細胞を慎重にスクリーニングし、単離することが重要となります。相同遺伝子座の両方に同様の遺伝子改変が必要な場合は、同じノックイン手順が必要になります。
PAM配列が必要：CRISPR/Cas9標的配列はgRNA認識配列の3‘末端直後にPAM配列として“NGG“が必要です。標的配列にはPAM配列が必要ですが、ドナーベクター中のPAM配列は改変する必要があります。
技術的な煩雑さ: トランスジェニックハエの作製は胚へのインジェクションやハエの飼育・交配など、高い技術が要求されます。
基本コンポーネント
5’-Homology (Left) Arm: 挿入部位のすぐ上流の相同配列。
attP: φC31 attP “着地点”サイト。attBを含むプラスミドは、HDR後にattPサイトに組み込まれる。
LoxP: Creリコンビナーゼ認識部位
3×P3-DsRed: 3×3プロモーターからDsRed蛍光マーカーが発現される。遺伝子組み換えハエの同定に使用される。
3’-Homology (Right) Arm: 挿入部位のすぐ下流の相同配列。
SV40 late pA: Simian virus 40ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。
pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。
Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。